Cientistas de Princeton resolvem um mistério bacteriano

Os pesquisadores descobriram que as colônias de bactérias são formadas em três dimensões com formas ásperas e semelhantes a cristais.

As colônias bacterianas geralmente crescem em linhas em placas de Petri em laboratórios, mas até agora ninguém entendia como as colônias se organizam em ambientes 3D mais realistas, como tecidos e géis em corpos humanos ou solo e sedimentos no ambiente. Esse conhecimento pode ser importante para o avanço da pesquisa ambiental e médica.

uma Universidade de Princeton A equipe agora desenvolveu uma maneira de monitorar bactérias em ambientes 3D. Eles descobriram que, à medida que as bactérias crescem, suas colônias formam continuamente formas maravilhosamente irregulares, semelhantes a uma cabeça ramificada de brócolis, muito mais complexa do que vemos em uma placa de Petri.

“Desde que as bactérias foram descobertas há mais de 300 anos, a maioria das pesquisas de laboratório as estudou em tubos de ensaio ou em placas de Petri”, disse Sujit Datta, professor assistente de engenharia química e biológica da Universidade de Princeton e principal autor do estudo. Isso foi resultado de limitações práticas, e não de falta de curiosidade. “Se você tentar observar o crescimento de bactérias no tecido ou no solo, verá que elas são opacas e não é possível ver o que a colônia está fazendo. Esse foi o verdadeiro desafio.”

Os pesquisadores são Sujit Datta, professor assistente de engenharia química e biológica, Alejandro Martínez Calvo, pesquisador de pós-doutorado, e Ana Hancock, estudante de pós-graduação em engenharia química e biológica. Crédito: David Kelly Crowe da Universidade de Princeton

O grupo de pesquisa de Data descobriu esse comportamento usando uma configuração experimental pioneira que lhes permite fazer observações inéditas de colônias bacterianas em seu estado tridimensional natural. Inesperadamente, os cientistas descobriram que o crescimento de colônias selvagens se assemelha consistentemente a outros fenômenos naturais, como o crescimento de cristais ou a propagação de geada no vidro da janela.

“Esses tipos de formas irregulares e ramificadas são onipresentes na natureza, mas geralmente no contexto de sistemas inanimados crescentes ou aglomerados”, disse Datta. “O que descobrimos é que o crescimento em colônias bacterianas 3D exibe um processo muito semelhante, apesar do fato de serem grupos de organismos”.

Esta nova explicação de como as colônias de bactérias evoluem em três dimensões foi publicada recentemente na revista Anais da Academia Nacional de Ciências. Datta e seus colegas esperam que suas descobertas ajudem uma ampla gama de pesquisas sobre crescimento bacteriano, desde a criação de antimicrobianos mais eficazes até pesquisas farmacêuticas, médicas e ambientais, bem como procedimentos que aproveitam as bactérias para uso industrial.

Pesquisadores de Princeton no laboratório. Crédito: David Kelly Crowe da Universidade de Princeton

“Em um nível fundamental, estamos entusiasmados com o fato de este trabalho revelar conexões surpreendentes entre a evolução da forma e função em sistemas biológicos e estudos de processos de crescimento não-vivos em ciência de materiais e física estatística. Mas também acreditamos que esta nova visão sobre quando e onde as células crescem em 3D será de interesse para qualquer pessoa interessada em crescimento bacteriano, como em aplicações ambientais, industriais e biomédicas”, disse Datta.

Há vários anos, a equipe de pesquisa de Datta desenvolve um sistema que permite analisar fenômenos que normalmente estariam encobertos em condições opacas, como o fluxo de fluidos no solo. A equipe usa hidrogéis especialmente projetados, que são polímeros absorventes de água semelhantes aos encontrados em lentes de contato e geléias, como matrizes para apoiar o crescimento de bactérias em 3D. Ao contrário das versões comuns de hidrogéis, os materiais Data consistem em esferas muito pequenas de hidrogel que são facilmente deformadas por bactérias, permitem a passagem livre de oxigênio e nutrientes que suportam o crescimento bacteriano e são transparentes à luz.

“É como um poço de bolas onde cada bola é um hidrogel individual. É microscópico, então você realmente não pode vê-lo”, disse Datta. A equipe de pesquisa calibrou a composição do hidrogel para imitar a estrutura do solo ou tecido. O hidrogel é forte o suficiente para suportar o crescimento da colônia bacteriana sem introduzir resistência, suficiente para restringir o crescimento.

“À medida que as colônias bacterianas crescem na matriz de hidrogel, elas podem reorganizar facilmente os glóbulos ao seu redor para que não fiquem presas”, disse ele. “É como afundar o braço em um poço de bolas. Se você puxá-lo, as bolas se reorganizam em torno do seu braço.”

Os pesquisadores experimentaram quatro tipos diferentes de bactérias (incluindo uma que ajuda a criar o sabor pungente do kombucha) para ver como elas cresciam em três dimensões.

“Mudamos os tipos de células, as condições dos nutrientes e as propriedades do hidrogel”, disse Datta. Os pesquisadores observaram os mesmos padrões grosseiros de crescimento em todos os casos. “Mudamos sistematicamente todos esses parâmetros, mas isso parece ser um fenômeno geral”.

Dados disseram que dois fatores parecem estar causando crescimentos em forma de couve-flor na superfície da colônia. Primeiro, as bactérias com níveis mais altos de nutrientes ou oxigênio crescerão e se multiplicarão mais rapidamente do que aquelas em um ambiente menos abundante. Mesmo os ambientes mais consistentes têm algumas densidades de nutrientes desiguais, e essas diferenças fazem com que pontos na superfície da colônia avancem ou fiquem para trás. Isso se repete em três dimensões, fazendo com que a colônia de bactérias forme protuberâncias e nódulos, pois alguns subconjuntos de bactérias crescem mais rapidamente do que seus vizinhos.

Em segundo lugar, os pesquisadores observam que, no crescimento 3D, apenas as bactérias próximas à superfície da colônia crescem e se dividem. As bactérias espremidas no centro da colônia parecem entrar em um estado de hibernação. Como as bactérias no interior não estavam crescendo e se dividindo, o exterior não experimentou a pressão que faria com que se expandisse uniformemente. Em vez disso, sua expansão é impulsionada principalmente pelo crescimento ao longo da borda da colônia. O crescimento ao longo da borda está sujeito a mudanças de nutrientes que eventualmente levam a um crescimento atrofiado e errático.

“Se o crescimento fosse uniforme e não houvesse diferença entre as bactérias dentro da colônia e as da periferia, seria como encher um balão”, disse Alejandro Martínez Calvo, pesquisador de pós-doutorado da Universidade de Princeton e primeiro autor do artigo. . “A pressão de dentro preencherá qualquer turbulência nas extremidades.”

Para explicar por que esse estresse não estava presente, os pesquisadores adicionaram uma marca fluorescente às proteínas que se tornam ativas nas células quando as bactérias crescem. A proteína fluorescente brilha quando as bactérias estão ativas e permanece escura quando não estão. Ao observar as colônias, os pesquisadores viram que as bactérias na borda da colônia eram verdes brilhantes, enquanto o núcleo permanecia escuro.

“A colônia basicamente se organiza em um núcleo e uma casca que se comportam de maneiras muito diferentes”, disse Datta.

A teoria, disse Datta, é que as bactérias nas bordas da colônia absorvem a maior parte dos nutrientes e oxigênio, deixando pouco para as bactérias internas.

“Achamos que eles hibernam porque estão com fome”, disse Datta, embora tenha alertado que mais pesquisas são necessárias para explorar isso.

Data disse que experimentos e modelos matemáticos usados ​​pelos pesquisadores descobriram que havia um limite superior para as cristas que se formaram nas superfícies da colônia. A superfície irregular é o resultado de diferenças aleatórias de oxigênio e nutrientes no ambiente, mas a aleatoriedade tende a estar dentro de certos limites.

“A aspereza tem um limite superior de quão grande pode ser – o tamanho de uma florzinha se compararmos com um brócolis”, disse ele. “Fomos capazes de prever isso com a matemática, e parece ser uma característica inevitável do crescimento de grandes colônias em 3D”.

Como o crescimento bacteriano tende a seguir um padrão semelhante ao crescimento de cristais e outros fenômenos bem estudados de materiais não vivos, Datta disse que os pesquisadores foram capazes de adaptar modelos matemáticos padrão para refletir o crescimento bacteriano. Ele disse que pesquisas futuras provavelmente se concentrarão em entender melhor os mecanismos por trás do crescimento, as implicações para formas de crescimento irregular do funcionamento da colônia e aplicar essas lições a outras áreas de interesse.

“Em última análise, este trabalho nos dá mais ferramentas para entender e, finalmente, controlar como as bactérias crescem na natureza”, disse ele.

Referência: “Instabilidade morfológica e crescimento grosseiro de colônias bacterianas tridimensionais” por Alejandro Martínez-Calvo, Tapumoy Bhattacharjee, R Conan Pai, Hau Njie Lu, Anna M Hancock, Ned S. Wingreen e Sojit S-Data, 18 de outubro de 2022, disponível aqui. Anais da Academia Nacional de Ciências.
DOI: 10.1073/pnas.2208019119

O estudo foi financiado pela National Science Foundation, New Jersey Health Foundation, National Institutes of Health, Eric and Wendy Schmidt Transformational Technology Fund, Pew Medical Scientists Fund e Human Frontier Science Program.